"Die letzte Reise der Osiris" ist eine animierte Kurzfilm-OVA, die im Universum der "Matrix"-Reihe angesiedelt ist. Die Handlung spielt zwischen den Ereignissen von "The Matrix" und "The Matrix Reloaded" und dient als Bindeglied zwischen den beiden Filmen. Die Geschichte beginnt an Bord des Hovercrafts Osiris, das von einer Crew bemannt ist, die in der realen Welt gegen die Maschinen kämpft. Die Hauptfiguren sind Jue, die Kapitänin der Osiris, und ihr Copilot Thadeus, die eine romantische Beziehung miteinander teilen.

Während einer Routinepatrouille entdeckt die Osiris eine riesige Armee von Maschinen, die dabei sind, einen Tunnel zu graben, der direkt zur letzten menschlichen Stadt, Zion, führt. Die Crew erkennt die unmittelbare Bedrohung und beschließt, diese Information an die anderen menschlichen Widerstandskämpfer weiterzugeben. Um dies zu erreichen, müssen sie jedoch die feindlichen Maschinen überwinden, die die Osiris verfolgen und angreifen.

In einem verzweifelten Versuch, die Nachricht zu übermitteln, steuert Jue das Schiff in eine gefährliche Zone, während Thadeus eine Nachricht in die Matrix sendet, die später von der Crew der Nebukadnezar gefunden wird. Die Osiris wird schließlich von den Maschinen zerstört, und die gesamte Besatzung kommt ums Leben. Trotz ihres Untergangs gelingt es ihnen, die Warnung zu übermitteln, was für die Verteidigung Zions von entscheidender Bedeutung ist.

Die Handlung konzentriert sich auf die Opferbereitschaft der Crew und die Bedeutung ihrer Entdeckung für den Fortbestand der menschlichen Zivilisation. Die Charaktere, insbesondere Jue und Thadeus, verkörpern die Entschlossenheit und den Mut der menschlichen Widerstandskämpfer in einem aussichtslosen Kampf gegen die übermächtigen Maschinen. Die OVA verbindet actionreiche Szenen mit emotionalen Momenten, die die Tragik ihres Schicksals unterstreichen.