Mario arbeitet als Lebensmittelhändler neben seinem Bruder Luigi in ihrem Geschäft. Eines Nachts, während er ein Videospiel spielt, sieht er, wie Prinzessin Peach aus dem Fernseher auftaucht und um Hilfe fleht, während sie vor König Koopa flieht. Mario versucht, sie zu verteidigen, wird aber überwältigt, und Koopa entführt Peach und kehrt durch den Bildschirm zurück. Das einzige zurückgelassene Zeichen ist eine kleine grüne Halskette, die während des Kampfes fallen gelassen wurde.

Am nächsten Tag ist Mario noch immer von dem Ereignis und der Halskette beunruhigt. Luigi erkennt den Edelstein aus einem Buch und glaubt, dass er sie ins Pilzkönigreich führen kann, ein Land, von dem es heißt, dass es große Schätze birgt. Ihre Verfolgung einer hundähnlichen Kreatur namens Kibidango, die die Halskette stiehlt, führt sie in eine Warp-Röhre. Sie tauchen im Pilzkönigreich auf, wo ein Pilz-Eremit enthüllt, dass er sie herbeigerufen hat. Er erklärt, dass das Königreich von König Koopa angegriffen wird, der die Bürger in leblose Objekte verwandelt, nachdem Prinzessin Peach seinen Heiratsantrag abgelehnt hat. Eine Prophezeiung identifiziert Mario und Luigi als diejenigen, die dazu bestimmt sind, Koopa zu besiegen. Der Eremit rät, dass sie drei mystische Power-Ups finden müssen: einen Super-Pilz, eine Feuerblume und einen Sternenmann.

Mario ist entschlossen, Peach zu retten und das Königreich zu retten, während Luigi hauptsächlich von der Aussicht auf Goldmünzen motiviert ist. Ihre Reise wird von Kibidango geleitet. Mario zeigt Durchhaltevermögen und Ehre. Er erwirbt den Super-Pilz, der ihm erhöhte Größe und Stärke verleiht, und die Feuerblume, die es ihm ermöglicht, hüpfende Feuerbälle zu schießen. Er nutzt diese, um Hindernisse und Feinde wie Koopa Troopas, Bullet Bills und Buzzy Beetles zu überwinden.

Marios Problemlösungsfähigkeiten werden deutlich, wenn er gefährliche Situationen meistert, aus einem von Piranha-Pflanzen befallenen Garten entkommt, Angriffen eines Lakitu ausweicht und aus einer Gefängniszelle ausbricht. Schließlich holt er das letzte Power-Up, den Sternenmann, aus dem Wasser, nachdem Luigi ihn versehentlich fallen gelassen hat. Mit einem gesunkenen Schiff reisen Mario, Luigi und Kibidango zu Koopas Schloss.

Mario trifft bei der Hochzeitszeremonie ein und konfrontiert König Koopa. Anfangs reichen die Power-Ups nicht aus und Mario wird fast besiegt. Er verwendet den Sternenmann, der Unverwundbarkeit und verstärkte Kraft verleiht, was es ihm ermöglicht, Koopa zu überwältigen und zu besiegen. Die Niederlage bricht Koopas Zauber und stellt das Pilzkönigreich und seine verwandelten Bürger wieder her.

Anschließend gibt Mario Peach die Halskette zurück. Dies führt dazu, dass Kibidango in seine wahre Gestalt zurückkehrt, Prinz Haru des Blumenkönigreichs. Er erklärt, dass er Peachs Verlobter ist und von Koopa in einen Hund verwandelt wurde. Mario ist untröstlich, als er erfährt, dass Peach Haru heiraten wird, akzeptiert die Situation und wünscht ihnen alles Gute. Mario und Luigi versprechen, bei Bedarf zurückzukehren, bevor sie nach Hause reisen.

In einer Post-Credit-Szene sind König Koopa und seine Handlanger zu sehen, die als Teil ihrer Strafe im Lebensmittelgeschäft der Brüder arbeiten.

Mario wird gelegentlich als übergewichtig angesehen und hat schwarze Haare, dunkelbraune Augen und ein rundes Gesicht. Er trägt typischerweise ein rotes Hemd, blaue Overalls mit gelben Knöpfen, eine rote Kappe mit einem „M“-Abzeichen, weiße Handschuhe und braune Stiefel.

Seine Persönlichkeit ist von einem starken Gerechtigkeitssinn und Entschlossenheit geprägt, besonders wenn er motiviert ist, Peach zu retten und das Königreich zu retten. Er kann impulsiv und leicht abgelenkt sein, zum Beispiel durch Essen während eines kritischen Kampfes. Mario zeigt auch tiefe emotionale Beteiligung, wie in seiner Untröstlichkeit über Peachs Verlobung zu sehen ist, obwohl er letztendlich ihr Glück priorisiert.

Mario